Фосфорили́рование — реакция замещения атома водорода в химических соединениях остатком фосфорной кислоты, преимущественно ортофосфорной H3PO4. К веществам, наиболее склонным к фосфорилированию, относятся спирты, меркаптаны, первичные и вторичные амины, углеводороды (по радикальному механизму), алкилгалогениды (по ионному механизму). Фосфорилирование имеет большое значение для осуществления многих процессов метаболизма в живых организмах — в процессах окисления, при синтезе нуклеиновых кислот и белков. Пример реакции фосфорилирования:
C2H5OH + CIP(O)(OCH3)2→ C2H5OP(O)(OCH3)2 + HCl.