Создан в 1321 на средства Флорентийской республики, на основе школы, открытой в 825 и упоминавшейся уже в 1203 под название «университет». Принятый в 1387 устав стал образцом для других университетов Италии. Расцвет университета приходится на первую половину 15 в., наибольшее развитие получили кафедры медицинских и юридических наук. В 1472 университет переведен в Пизу, во Флоренции остались кафедры филологии, философии, теологии; в дальнейшем здесь созданы кафедры математики, астрономии, физики, зоологии, ботаники, минералогии. В университете преподавали известные итальянские ученые Бальд, Никколи, А. Полициано, Р. Лонги, Г. Сальвемини, Л. Пачоли, А. Чезальпино, Э. Торричелли, Ф. Реди, титул «первого математика» университета имел Г. Галилей. Деятельность университетских кафедр была централизована правительственным декретом (1859), по которому университет был преобразован в институт высших практических исследований и усовершенствования; с 1924 — современное название.
В состав Флорентийского университета в 2005 входило 12 факультетов — сельскохозяйственный, архитектурный, экономический, фармацевтический, юридический, инженерного дела, литературы и философии, медицины и хирургии, психологический, политических наук, математических и естественных наук, педагогических наук; свыше 20 научно-исследовательских институтов; библиотека, которая объединяет центральную национальную библиотеку (основана 1747, свыше 4 млн томов) и библиотеку Маручелли (основана 1752, около 0, 5 млн томов рукописей, инкунабул и старейших изданий); обсерватория; музей естественной истории. В 2005 в университете обучалось 30 тыс студентов.